第四军医大学西京医院心内科  曹 丰
Cao F et al. PLOs One， 2008;3(10):e3474. Epub 2008 Oct 22.

摘要：
    人胚胎干细胞（hESCs）是组织及器官再生中重要的种子细胞来源。 本文采用hESCs分化后的心肌细胞（hESCs-CM）对小鼠心肌缺血再灌注损伤的修复进行了观察。并采用基因芯片技术，系统观察了未分化hESCs 与人胚胎心肌细胞之间基因表达谱的变化。发现hESCs来源的心肌细胞所表达的心肌特异性基因与20周龄胎儿心肌细胞表达水平相近， 因此hESCs-CM可以作为心肌替代治疗的备选细胞。超声心动图结果显示心脏功能在细胞移植后8周可明显改善。最后我们采用分子影像手段观察并证实移植的hESCs-CM在心肌中的定位及存活。总之，人胚胎干细胞分化中对基因表达整体变化的观察有助于对细胞分化的生物学进程、生物结构网络信息以及细胞分化关键基因进行确定。该类研究可进一步对干细胞治疗到临床应用提供理论依据。

背景：
    近年来心肌梗塞（MI）的发病率和死亡率不仅在西方国家在我国也居高不下。心梗发作时，由于局部缺血严重限制了残存心肌细胞的增殖能力，受损的心脏极易发生病理性重构以及心力衰竭。目前的药物及介入治疗仅仅希望能够维持存活心肌的功能，但很多情况下仍不能逆转心脏功能的进行性下降。，尽管心脏移植是终末期心衰病人唯一有效的根治手段，但是心脏器官供体缺乏以及左室辅助装置伴随频繁感染等问题持续出现，一直是临床医生的一大困扰。 近年来，由于干细胞疗法中所需的心肌细胞、内皮细胞和其他类型的分化细胞获取方便，并能应用于心肌损伤后修复期，使其作为一种治疗缺血性心脏病的候选方法有着广阔的应用前景。

    人胚胎干细胞由于具有自我更新和全能分化的能力而倍受瞩目。由于hESCs可体外大量诱导分化为人体各组织器官的细胞，因此成为组织修复及细胞替代治疗的有力选择。但是，一旦移植未分化的hESCs， 移植后的未分化细胞很快分化增殖形成具有三个胚层细胞混乱论排列的畸胎瘤。然而，在特定诱导分化条件下hESCs在体外经过胚样体过程可直接分化为搏动的心肌细胞。随后采用密度梯度分离可对心肌细胞进一步富集并数倍提高心肌细胞数量及比率，因此，对纯化富集hESCs来源的心肌细胞用于细胞治疗是一种创新并可行的治疗策略， 可降低细胞副反应及畸胎瘤的形成。

    为了确定hESCs向心肌分化过程各阶段中细胞分子水平的变化，我们采用人类全基因组基因芯片对hESCs分化各阶段细胞基因表达谱进行了研究。这一方法有助于我们了解某些特殊基因的激活阶段以及细胞分化及发育进程，从而确定对细胞分化有介导作用的新基因及分化各阶段的基因标志物。也许在不久的将来，这些重要基因可能对细胞治疗前的预分化起到重要的作用。为了监测细胞的在体存活情况，我们采用分子影像学技术对细胞移植后小鼠反复进行活体无创的细胞生物发光信号的定量测定。 运用遗传学和影像学手段，我们研究了控制心肌细胞分化的分子框架网络，以及对缺血再灌注损伤治疗的活体评估。

hESCs 向心肌细胞分化

     分化方法及流程如下图

 
    为观察细胞转录变化的时程，我们采用RT-PCR 对胚样体0 至42天样本进行分析，发现干细胞标志物(Oct4， NANOG， Rex1) 在分化后28天持续下降， 而心肌细胞早期转录因子(Nkx2.5， MEF2C)在分化后14-28天显著增高。心脏晚期特异性基因(aMHC， ANF) 在分化后14开始持续表达。在心肌细胞富集之前，EB中仅仅有2-5% 心肌细胞， 但是富集后可以获得约45%阳性表达肌钙蛋白的心肌细胞 。

细胞分化发育阶段基因表达的重要变化

    进行人胚胎干细胞体外培养及分化诱导， 细胞分组（每组4份）为： (i)未分化hESCs；(ii)分化第10天并出现规律性自发搏动的胚样体（EB， Embryoid Body）；(iii)分化14天Percoll-富集后的心肌细胞，(iv) 人胚胎心室肌细胞（获家属同意及伦理学批准后可取自20周龄流产胎儿）。从细胞样品中提取总cDNA，并与人类全基因组基因芯片杂交。胚胎和成体心脏中包含多种细胞类型，例如心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞等。因此，我们将左室心肌细胞单独分离出来，进行基因芯片分析，这样做可以防止其他非心肌细胞的干扰，结果分析采用SAM软件来确定不同分化阶段差异表达基因。为了得到转录谱的总体情况，我们采用基本组分分析法（PCA），这一方法可以观察全基因组表达趋势情况。结果显示：每一阶段的4个样本之间，转录表达非常相似，但组间存在较大差异。相邻的两个阶段基因表达进展情况显示，某些与分化相关的基因呈进行性升高或下降。而这一模式我们在聚类分析中同样能看到相似的结果。

    未分化的人胚胎干细胞表达具有独特的生物学特性和分子标签。

    我们采用统计学的生物学进程分析发现，与细胞周期，有丝分裂和核酸形成相关的基因在未分化细胞中表达最高，这也证实了ES细胞的强自我更新能力，同时我们也发现ES细胞具有与多向分化潜能相关的重要基因如NANOG等，当我们将hESC与EB细胞比较时发现，约有2219个基因在未分化细胞中高表达，其中增高最明显的基因为NANOG，约增高250倍，其次是OCT-4，增高了260倍，SOX-2增高了160倍，TDGF1的表达增高约100倍。

搏动的EB细胞表达较多的间充质及心脏特异性基因

    细胞分化到搏动的EB阶段非常令人兴奋，EB中包含多种细胞群，我们的结果显示，在这一阶段，主要的心脏转录因子及心脏特异的结构和功能基因均明显上调，提示细胞向中胚层的心肌细胞分化，但是，我们也发现其他三个胚层的分化基因，其中包括：神经系统、肾脏、骨骼肌等等。

    富集的心肌细胞中早期中胚层基因下调，心血管及心脏结构基因上调，我们发现，搏动的EB细胞与心肌细胞相比，约有2389个基因表达升高，其中主要包括早期的间充质基因，如TWIST， MEOX2，心脏及肌肉基因LMO7上调3.5倍，actin上调5倍。在这一阶段里，细胞间结构和胶原成分的相关基因同时表达上调。

富集的心肌细胞与胎儿心肌细胞比较，有明显能量代谢差异

    理想的心肌细胞种子细胞应当保持有丝分裂的能力，才能在心肌再生中起到一定作用，因此我们选择胎儿心肌细胞作为金标准进行比较，因为这种细胞类型仍保持一定的增殖能力。从总体上看，心脏的结构及力学相关基因的表达hESC-CM与FH两者相近。但是在胎儿心肌细胞中与细胞线粒体呼吸链和脂肪代谢相关的基因表达明显增高，而这些与能量相关的途径是具有收缩功能的成熟心肌细胞必需的，它们表达的时间段与胎儿发育阶段相关。我们知道，出生后的心肌细胞代谢主要与脂肪代谢相关。

细胞电生理比较

    为明确hESC-CM的电生理特性，我们采用全细胞膜片钳的方法观察了hESC-CM动作电位，根据其动作电位的上升支速率，振幅等形态及静息电位，可将hESC-CM进一步区分为P细胞、心房、心室样细胞亚型。我们也观察了对于兴奋－收缩耦联至关重要的钙瞬变情况。在细胞分化3或6周后，在形态学上可辨认出P细胞、心房、心室样细胞。值得注意的是，hESC-CM来源的心室样细胞的静息电位与胎儿心肌细胞最为相似。
细胞移植可改善心肌梗死小鼠左室心脏功能

    我们采用SKID小鼠心肌内注射1×106个细胞，构建小鼠心肌缺血30min/再灌注模型，术后采用超声心动图观察左室功能情况发现，术后8周细胞治疗组短轴缩短率改善12.5%，左室收缩末容积减小，舒张末容积无明显变化。我们也发现移植区血管密度及血管新生增加，然而，左室功能恢复并不能持续到16周以上，其原因尚不明确，我们猜测与细胞的急性死亡相关，为证实这一假说，我们决定用分子影像对细胞进行活体示踪。

    报告基因影像进行活体示踪：细胞移植后，对动物进行为期8周的生物发光影像观察，结果显示，细胞存活在前3周迅速下降，死亡约90％，此后维持在较低水平。还有一点重要的观察结果是，移植的细胞仍然存活在心脏组织中，在研究过程中，我们并未发现畸胎瘤形成及细胞恶变。相反，注射1×106未分化细胞后，心内及心外均有畸胎瘤形成，随后我们又进行了细胞数量与畸胎瘤相关性的研究，发现心脏内注射1×105未分化细胞即可导致畸胎瘤形成。

移植细胞的组织学评价

    组织学观察发现，只有较少的hESC-CM整合到宿主细胞中，这一点很难解释心脏功能的修复，因此，我们考虑可能是旁分泌、血管新生、抗凋亡等机制参与了心脏功能的修复。

    本文中我们观察了hESC-CM不同分化阶段的转录谱表达并与胎儿心肌细胞进行了比较，采用分子影像观察细胞存活情况。hESC全基因表达谱为干细胞的生物学进程，网络构建以及细胞分化选择提供了系统的分析方法，这一宏观生物学进程明显优于传统的PCR技术，因为PCR仅能测定少量的转录表达，不能进行高通量表达分析。

    在我们的试验中发现，仅有2－5％的hESC分化为心肌细胞。在聚类分析过程中，Cluster2共含有2453个基因，从ESC到EB再到ESC来源的心肌细胞及胎儿心肌细胞，这些表达逐渐降低。这一Cluster主要与核酸合成，DNA复制，细胞周期及转录相关，提示未分化细胞具有快速的自我复制和增殖能力。Cluster3包含1009个基因，这些基因与非心肌细胞分化途径，部分神经外胚层分化相关，这些<